苹果酸脱氢酶（MDH）活性测定：细胞代谢稳态的关键调控者

苹果酸脱氢酶（Malate Dehydrogenase，MDH，EC 1.1.1.37）是一类广泛存在于生物界的脱氢酶，在动物组织、植物器官、微生物细胞及体外培养细胞中均有分布，是维持细胞代谢稳态的关键酶之一。其酶促反应具有明显的亚细胞定位特异性：线粒体中的 MDH作为三羧酸循环（TCA 循环）的核心酶组分，催化苹果酸氧化生成草酰乙酸，为 TCA 循环的持续进行提供关键中间产物；而胞浆中的 MDH则催化逆反应，即草酰乙酸还原生成苹果酸，二者协同维持胞内苹果酸与草酰乙酸的平衡。

草酰乙酸作为代谢网络中的重要节点分子，不仅是 TCA 循环的关键中间物，还可通过转氨基作用生成天冬氨酸，参与尿素循环、嘌呤合成及氨基酸代谢，同时也是糖异生途径的起始底物之一。因此，MDH 的活性直接调控细胞内能量代谢（线粒体氧化磷酸化）、苹果酸 - 天冬氨酸穿梭系统（胞浆与线粒体间 NADH 的转运）、活性氧（ROS）清除（通过维持 NADPH/NADP + 平衡）及生物胁迫抗性（植物抗病、微生物抗逆）等多种生理过程，是评价细胞代谢状态的重要指标酶。

根据酶促反应依赖的辅酶类型，MDH 可分为两类：NAD - 依赖型 MDH（NAD-MDH） 和NADP - 依赖型 MDH（NADP-MDH） 。二者在分布上存在显著差异：原核生物（如细菌）中通常仅含有 NAD-MDH，而在真核细胞中，NAD-MDH 主要分布于细胞质基质和线粒体基质中，NADP-MDH 则多存在于叶绿体（植物）、过氧化物酶体等细胞器中，本次实验聚焦于 NAD-MDH 的活性测定。

测定原理

基于 NAD-MDH 催化的可逆反应特性，本次实验采用还原方向反应进行活性测定，即利用 NAD-MDH 催化草酰乙酸（底物）在 NADH（还原型辅酶）的参与下还原生成苹果酸，同时 NADH 被氧化为 NAD+（氧化型辅酶）。反应式如下：

草酰乙酸 + NADH + H⁺ → 苹果酸 + NAD⁺

由于 NADH 在紫外光区（340nm 波长）具有特异性光吸收（摩尔吸光系数 ε=6220 L・mol⁻¹・cm⁻¹），而 NAD + 在该波长下无明显吸收，因此反应过程中 340nm 处光吸收值的下降速率与 NAD-MDH 的活性呈正相关。通过紫外分光光度计或酶标仪实时监测 340nm 处吸光度的变化，根据吸光度下降速率即可计算出样品中 NAD-MDH 的活性。

三、需自备的仪器和用品

为确保实验顺利开展，需提前准备以下仪器设备及耗材，所有仪器需在实验前进行校准，耗材需经无菌处理（如需测定无菌样品）或清洁处理，避免杂质干扰酶促反应：

紫外分光光度计 / 酶标仪：需具备 340nm 波长检测功能，支持连续监测（动力学模式），分光光度计需配套石英比色皿适配的比色池，酶标仪需支持 96 孔板（建议为紫外透明板，如石英材质或专用紫外 96 孔板）检测，分辨率不低于 0.001 Abs。

台式离心机：最大转速不低于 12000×g，支持 4℃低温离心（用于样品匀浆后的沉淀去除，避免蛋白杂质干扰），需配备 1.5mL 或 2mL 离心管适配转子。

恒温水浴锅：温度控制精度 ±0.5℃，可稳定维持反应温度（通常为 30℃或 37℃，具体根据物种最适温度调整），需提前预热至设定温度。

2. 样品处理与加样工具

可调式移液器：量程覆盖 10μL~1000μL（建议配备 10μL、100μL、1000μL 三种规格），需配套相应规格的无菌吸头（低吸附吸头优先，减少酶蛋白吸附损失），使用前需校准移液精度。

微量石英比色皿 / 96 孔板：若使用分光光度计，需准备光程为 1cm 的微量石英比色皿（容积约 500μL~1mL），石英材质可避免紫外光吸收干扰；若使用酶标仪，需选择紫外透明 96 孔板（不可使用普通塑料板，其会吸收 340nm 紫外光），建议为平底设计以保证检测一致性。

蒸馏水：需为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ・cm），用于配制缓冲液、稀释样品及清洗仪器，避免离子或有机物污染影响酶活性。

其他辅助耗材（根据样品类型准备）：如组织匀浆器（用于动物 / 植物组织样品破碎）、无菌离心管（1.5mL/2mL）、移液器吸头盒、一次性手套、无尘纸等。